SZÚ

Kontaktní údaje


Státní zdravotní ústav
Šrobárova 49/48
Praha 10, 100 00
Tel.: 26708 1111
E-mail: zdravust@szu_cz
Běžný tvar e-mailu zaměstnanců SZÚ:
jmeno.prijmeni @ szu.cz
Datová schránka: ymkj9r5
IČ: 75010330
DIČ: CZ75010330
Č. účtu: 1730101/0710
Profily zadavatele:
e-Gordion
Tendermarket
NEN
Home » Centra » Centrum epidemiologie a mikrobiologie » Národní referenční pracoviště v CEM » Národní referenční laboratoř pro antibiotika » Doporučené postupy » Stafylokoky - průkaz indukované rezistence ke...
Stáhnout článek jako PDF Vytisknout

Stafylokoky - průkaz indukované rezistence ke klindamycinu (D – test)


Revize 27. 1. 2014

 

A.  Klinické vzorky pro vyšetření citlivosti

  • Citlivost k antibiotikům (včetně průkazu indukované rezistence ke klindamycinu) se vyšetřuje pouze u izolátů Staphylococcus spp. izolovaných z relevantních vzorků, odebraných v souvislosti s klinicky manifestní infekcí, případně u kmenů MRSA, izolovaných z výtěrů od nosičů.
  • Nevyšetření indukované rezistence ke klindamycinu u kmenů stafylokoků může být příčinou selhání klindamycinu v léčbě /1 /.

 B.  Rezistence ke skupině antibiotik MLSB /1/

  • Antibiotika ze skupiny MLSB, ke kterým patří 14- a 16-členné makrolidy, 15-členný azalid azitromycin, linkosamidy linkomycin a klindamycin, a streptograminy skupiny B, mají stejný nebo velmi podobný mechanizmus účinku na grampozitivní koky.
  • Rezistence k antibiotikům skupiny MLSB může být způsobena různými mechanizmy. Nejčastěji je řízena geny erm (u stafylokoků jsou to geny ermA, ermB a ermC). Tyto geny determinují produkci ribozomální metylázy (erythromycin ribosomal methylase), která modifikuje cílové místo účinku všech antibiotik skupiny MLSB na ribozomu methylací 23S rRNA.
  • Geny msrA, které u stafylokoků řídí eflux makrolidů a azalidů z buňky, se jako příčina rezistence uplatňují méně často. U kmenů s tímto typem rezistence je účinek klindamycinu zachován.
  • Geny erm i msr jsou schopny rychle se šířit horizontálně, prostřednictvím transpozonů, nebo vertikálně, jako klony rezistentních kmenů.
  • Bodové mutace, v genech kódujících ribozomální proteiny, se na chromozomu stafylokoků jako příčina rezistence vyskytují vzácně. Mohou být například příčinou samostatné rezistence kmene k linkosamidům při zachování citlivosti k ostatním antibiotikům skupiny MLSB.

 C.  Fenotyp rezistence k antibiotikům MLSB /1/

  • Fenotypová exprese rezistence stafylokoků k antibiotikům skupiny MLSB závisí na tom, zda je rezistence způsobena metylázou syntetizovanou konstitutivně (gen ermB) nebo indukovaně (geny ermA a erm C), nebo zda je způsobena efluxem (geny msrA).
    • Konstitutivní fenotyp (cMLS): je snadno rozpoznatelný, neboť inhibiční zóny (IZ) nebo minimální inhibiční koncentrace (MIC) erytromycinu a klindamycinu jsou v kategorii rezistence.
    • Indukovaný fenotyp (iMLS): IZ nebo MIC erytromycinu jsou v kategorii rezistence, MIC klindamycinu (a obvykle i IZ) jsou v citlivé kategorii. K odhalení indukované rezistence ke klindamycinu lze použít například diskovou difuzní metodu s předepsaným uspořádáním disků, tzv. D-test, (viz dále).
    • M fenotyp (eflux): IZ nebo MIC erytromycinu jsou v kategorii rezistence, IZ nebo MIC klindamycinu jsou v kategorii citlivosti.
  • Buňka stafylokoka může obsahovat kombinaci různých genů, inaktivujících antibiotika skupiny MLSB, a fenotyp rezistence se může projevit nejednoznačně (např. růstem kolonií uvnitř IZ v rozdílné kvantitě).

 D.  Průkaz indukované rezistence (D - test) /2/

  • Indukovanou rezistenci nelze prokázat vyšetřením MIC, neboť distribuce MIC klindamycinu u kmenů citlivých k antibiotikům skupiny MLSB a kmenů s iMLS je téměř identická..
  • Klindamycin je špatný induktor ribozomální metylázy, erytromycin však produkci tohoto enzymu indukuje. K vyšetření indukované rezistence lze proto použít rutinní diskovou difuzní metodu za předpokladu, že disk s klindamycinem je umístěn v sousedství disku s erytromycinem.
  • Vzdálenost mezi okraji disků erytromycinu a klindamycinu u stafylokoků musí být v rozmezí 12-20 mm. Při dodržení této podmínky lze k vyšetření použít dispenzor disků.

 

Tabulka 1. Podmínky pro vyšetření fenotypu rezistence stafylokoků k antibiotikům MLSB /2,3/.

Půda

 Mueller Hinton agar (MH)

Objem inokula

 2 – 5 ml ve fyziologickém roztoku

Příprava inokula

Přímá metoda roztěrem kolonií z kultury vyrostlé MH agaru  přes noc

Koncentrace inokula

0,5 dle McFarlandova zákalu

Disky

Erytromycin (obsah 15 µg), klindamycin (obsah 2 µg)

Uspořádání disků

Vzdálenost 12-20 mm mezi okraji disků s erytromycinem a klindamycinem

Inkubace

35oC± 1oC v normální atmosféře po 18±2 h

Odečítání

Průměr inhibiční zóny od okrajů nevykazujících růst se měří v odraženém světle na spodní straně misky, umístěné na tmavém pozadí

Kontrolní kmen

S. aureus ATCC 29213*

 Kopie S. aureus ATCC 29213 v českých sbírkách kmenů: S. aureus CNCTC 5480, S. aureus  CCM 4223.

 

E.  Hodnocení výsledků

  • Změří se průměr inhibiční zóny (IZ) od jejího okraje se zřetelnou inhibicí růstu.
  • Průměry IZ kontrolního kmene musí být v rozmezí uvedeném v tabulce 2.
  • Vyšetřovaný kmen je k antibiotikům rezistentní, vytváří-li IZ o průměru menším, než je hraniční průměr IZ pro citlivé kmeny v tabulce 2.
  • Vytvoření deformované IZ ve tvaru písmene D (D zóny) kolem klindamycinu v oblasti sousedící s diskem erytromycinu svědčí o indukované rezistenci k antibiotikům MLSB.
  • Vytvoření deformované IZ, uvnitř které rostou kolonie (D+ zóna), může být způsobena přítomností různých genů MLSB rezistence
  • Tabulka 3 obsahuje fenotypy rezistence stafylokoků k antibiotikům skupiny MLSB , odvozené podle průměru a charakteru inhibičních zón kolem erytromycinu a klindamycinu.

 

Tabulka 2. Hraniční průměry inhibičních zón (IZ) pro citlivé kmeny stafylokoků a přípustné rozmezí inhibičních zón kontrolního kmene S. aureus ATCC 29213*.

                            Antibiotikum

Obsah disku

Hraniční průměry IZ

pro citlivé kmeny /3/

Přípustné rozmezí IZ  

S. aureus ATCC 29213*/4/

Erythromycin (ERY)

15 µg

≥ 21 mm

23 - 29 mm

Klindamycin (CLI)

2 µg

≥ 22 mm

23 - 29 mm

*  Kopie S. aureus ATCC 29213 v českých sbírkách kmenů: S. aureus CNCTC 5480, S. aureus  CCM 4223; IZ: inhibiční zóna.

 

Tabulka 3. Fenotyp rezistence stafylokoků k antibiotikům skupiny MLSB a hodnocení podle výsledků diskové metody.

Fenotyp

Charakter inhibiční zóny

Obrázek

citlivý

kmen kolem disků s ERY a CLI vytváří IZ shodné, nebo o větším průměru než je limit pro citlivé kmeny* 

Staphylococcus aureus - erytromycin citlivý

cMLS (konstitutivní rezistence)

kmen kolem disků s ERY a CLI nevytváří IZ žádné, nebo o menším průměru než je limit pro citlivé kmeny* 

Staphylococcus aureus - cMLS

iMLS (indukovaná rezistence)

kmen vytváří deformovanou IZ (D zónu) kolem disku s CLI v   oblasti, sousedící s diskem s ERY, kolem nějž nevytváří IZ žádné, nebo o menším průměru než je limit pro citlivé kmeny*  

Staphylococcus aureus - iMLS

M (eflux)

kmen kolem disku s ERY vytváří IZ menší než je limit pro citlivé kmeny v tabulce 2, IZ kolem disku s CLI není deformována a má průměr

stejný nebo větší než je limit pro citlivé kmeny*  

Staphylococcus aureus - M (eflux)


IZ - inhibiční zóna; ERY - erytromycin, CLI - klindamycin

 legenda k obrázkům: a) erytromycin (15µg), b) klindamycin (2µg)

* viz tabulka 2

 

 Tabulka 4. Interpretace výsledků /3/.

Fenotyp

Interpretace

citlivý

Kmen je citlivý k erytromycinu* i ke klindamycinu

cMLS (konstitutivní rezistence)

Kmen je rezistentní k erytromycinu* i klindamycinu

iMLS (indukovaná rezistence)

Kmen je rezistentní k erytromycinu* i klindamycinu;  krátkodobé použití klindamycinu, viz sdělování výsledků

M (eflux)

 Kmen je rezistentní k erytromycinu* a citlivý ke klindamycinu

 * a k dalším antibiotikům skupiny MLSB

 

 F.    Sdělování výsledků

  • Klindamycin je alternativa oxacilinu u některých infekcí, způsobených citlivými kmeny stafylokoků, zejména u osob přecitlivělých k penicilinu.
  • U infekcí kůže a měkkých tkání, způsobených komunitními kmeny MRSA (kmeny S. aureus rezistentními k oxacilinu a citlivými k většině dalších antibiotik), je klindamycin (vedle kotrimoxazolu) jednou z prioritních terapeutických alternativ.
  • Interpretace testů pro sdělování výsledků je v tabulce 4.
  • Při nezbytnosti lze pro krátkodobou léčbu méně závažných infekcí kůže a měkkých tkání použít klindamycin i u kmene s indukovanou rezistencí ke klindamycinu /3/.

 


Literatura

/1/     Roberts MC, Sutcliffe J, Courvalin P, Jensen LB, Rood J, Seppälä H. Nomenclature for macrolide and macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance determinants. Antimicrob Agents Chemother 1999; 43:2823-2830.

/2/     European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Disk difussion methodology. Dostupné na http://www.eucast.org/

/3/    European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Dostupné na http://www.eucast.org/

/4/    European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. EUCAST Routine QC tables. Dostupné na http://www.eucast.org/

 

 NRL pro antibiotika, Centrum epidemiologie a mikrobiologie,

Státní zdravotní ústav Praha

 

 

 

Nahoru