A.   Klinické vzorky pro vyšetření citlivosti

Citlivost streptokoků se vyšetřuje pouze u kmenů z relevantních vzorků.

Kultivace a vyšetření citlivosti kmenů S. pyogenes izolovaných z výtěru z krku je metodou volby u u pacientů s tonzilitidou.

B.   Rezistence ke skupině MLS_B  /1/

• U streptokoků (včetně pneumokoků) je rezistence k antibiotikům ze skupiny MLSB nejčastěji řízena geny erm (erythromycin ribosomal methylase).
• Geny ermB a ermA determinují produkci ribozomální metylázy inaktivující všechny 14-, 15- a 16-členné makrolidy, azalidy a streptograminB (MLSB).
• Méně často se uplatňují geny mef, které řídí eflux 14- a 15-členných makrolidů a azalidů z buňky, nikoli však linkosamidů a streptograminu.
• Geny erm i mef jsou schopny rychle se šířit horizontálně, prostřednictvím transpozonů, nebo vertikálně, jako klony rezistentních kmenů.
• Bodové mutace vgenech na chromozomu kódujících ribozomální proteiny se jako příčina rezistence streptokoků vyskytují vzácně.

C.   Průkaz fenotypu rezistence

• Fenotypová exprese buněk sgeny erm závisí na tom, zda je metyláza syntetizována konstitutivně (gen ermB) nebo inducibilně (gen ermA).
• Genotyp ermB vytváří u vyšetřovaného kmene snadno rozpoznatelný fenotyp konstitutivní rezistence (cMLS), kdy inhibiční zóny (IZ) nebo MIC antibiotik skupiny MLS_B jsou vkategorii rezistence.
• Vběžně uspořádaném testu citlivosti se fenotyp buněk sgeny ermA (iMLS_B) může projevovat jako vytvoření inhibičních zón kolem disků (nebo hodnot MIC) slinkosamidy a 16-člennými makrolidy vcitlivé kategorii (čili falešně jako fenotyp M), ačkoli ve skutečnosti je daný kmen ktěmto antibiotikům rezistentní /1/.
• Fenotyp rezistence kantibiotikům MLS_B se vyšetřuje běžně provedenou diskovou difusní metodou za dodržení obvyklých podmínek /2/. Odlišné je pouze uspořádání vzdálenosti mezi disky, a hodnocení výsledků.

D.    Metoda

 Tabulka 1. Přehled podmínek pro vyšetření fenotypu MLS_B

E.    Hodnocení výsledků

• Změří se průměr inhibiční zóny (IZ) od jejího okraje se zřetelnou inhibicí růstu.
• Průměry IZ kontrolních kmenů musí být vrozmezí uvedeném vtabulce 2.
• Citlivý kmen musí vytvářet IZ o průměru stejném nebo větším, než je hraniční průměr IZ pro citlivé kmeny vtabulce 2.
• Disk se spiramycinem je pomocný khodnocení indukce, a proto interpretace výsledku samotného spiramycinu není uvedena.
• Zaznamená se deformace IZ u klindamycinu a spiramycinu.
• Některé kmeny geny sermA (fenotyp iMLS) vytváří IZ jen u klindamycinu nebo jen u spiramycinu /3/, proto se doporučuje kromě erythromycinu použít oba tyto disky.

Tabulka 2. Hraniční průměry inhibičních zón (IZ) pro citlivé kmeny streptokoků a přípustné rozmezí inhibičních zón kontrolního kmene S. pneumoniae ATCC 49619 (CNCTC 5063)

ND - není k dispozici

F.     Interpretace a sdělování výsledků

• Výběr antibiotik postačuje pro předpověď účinnosti antibiotik ze skupiny MLS_B.
• Fenotyp cMLS, iMLS a M se v99,5% případů shoduje sgenotypem (průkazem genů ermB, ermA, respektive mef) /3/.
• Vtabulce 3 jsou výsledky získané vyšetřením genotypu a fenotypu MLS_B u 198 kmenů rezistentních kerythromycinu vNRL/ATB /3/.
• Interpretace výsledků vyšetření citlivosti kantibiotikům skupiny MLS_B je vtabulce 4.
• Návrh pro sdělování výsledků je vtabulce 5.

Tabulka 3. Vyšetření 198 kmenů rezistentních k erythromycinu v NRL/ATB /3/

* v případě že není přítomna u jednoho antibiotika, musí být přítomna u druhého antibiotika u kterého se hodnotí deformace IZ.

Tabulka 4. Fenotyp rezistence k antibiotikům skupiny MLS_B podle výsledků diskové metody

Fenotyp	Charakter IZ	obrázek
citlivý	kmeny kolem disků s ERY, CLI a SPI vytvářejí IZ shodné, nebo o větším průměru než je limit pro citlivé kmen
cMLS (konstitutivní rezistence)	kmeny kolem disků s ERY, CLI a SPI nevytvářejí IZ žádné, nebo o menším průměru než je limit pro citlivé kmen
iMLS (indukovaná rezistence)	kmeny vytvářejí charakteristickou deformovanou IZ kolem disku s CLI nebo SPI v oblasti sousedící s diskem s ERY, kolem nějž obvykle nevytvářejí žádné IZ
M (eflux)	kmeny kolem disku s ERY vytvářejí IZ menší než je limit pro citlivé kmeny, IZ kolem disků s CLI a SPI nejsou deformovány a mají průměr stejný nebo větší než je limit pro citlivé kmeny

legenda k obrázkům: a) erythromycin (15µg), b) klindamycin (2µg), c) spiramycin (100µg)

Tabulka 5. Návrh na sdělování výsledků

S podporou grantu IGA MZ NI/6799-3: Analýza příčin vzniku a šíření rezistence k antibiotikům u Streptococcus  pneumoniae a S. pyogenes v České republice.

Literatura

1.      Roberts MC, Sutcliffe J, Courvalin P, Jensen LB, Rood J, Seppälä H. Nomenclature for macrolide and macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance determinants. Antimicrob Agents Chemother 1999; 43:2823-2830.

2.      Urbášková P. Rezistence bakterií k antibiotikům. Vybrané metody. Trios 1998.

3.      Urbášková P, Jakubů V, Melter O. Analýza rezistence k antibiotikům ze skupiny makrolidů, linkosamidů a streptograminu_B (MLS_B). Zprávy CEM 2004; 13(1):25-27.

NRL pro antibiotika, Centrum epidemiologie a mikrobiologie,

Státní zdravotní ústav Praha